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口腔癌
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肺癌
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骨癌
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卵巢癌
香椿水煮粗萃物抗癌有效成分之分離研究
賈宜琛 博士 大仁科技大學 食品科技系
發現本植物具有抗癌與降血糖之活性，
顯示香椿表現出多元化的保健功效，
是藥食兼用的食材，
香椿對多種癌細胞株生長皆有抑制作用，
對癌細胞株有很強毒殺作用，
對於正常細胞並無傷害
前言
香椿（Toona sinensis Roem.; Cedrela sinensis A. Juss.）為楝科（Meliaceae）多年生落葉大喬木，樹幹直立，小枝皮孔小而顯著，髓心粗而圓；嫩芽有毛，全株具特異臭氣；葉具長柄、互生、偶數羽狀複葉，小葉具短小葉柄，7～9對、卵形披針形或披針狀長橢圓形，先端銳尖，基部近於圓形，疏細鋸齒緣，有時近於全緣，長9～18公分，寬3～5公分，裡面淡綠色，側脈9～11對；葉柄紅色，基部粗肥，上有淺溝。小葉10～22枚，具香氣。近期高雄醫學大學許勝光教授研究香椿的生理功效發現，由體外癌細胞實驗我們已知可對多種（肺癌：A549、H226，直腸癌：Colo205，骨癌：U-2 OS，肝癌：Hep G2，卵巢癌：SKOV3、PA-1，乳癌：MCF-7）人類癌細胞有抑制生長之作用，甚至啟動癌細胞凋亡（apoptosis）的機制，更重要是對癌細胞株有很強毒殺作用的濃度下，對於正常細胞並無傷害，如毒殺分析（MTT）試驗中不影響肺臟的正常細胞（MRC-5）生長。
香椿是藥食兼用的食材，全樹可利用，是經濟價值極高之樹種，亞蔬中心營養系代主任楊瑞玉研究百餘種蔬菜的抗氧化性，發現香椿排名第一，抗癌的效果比目前火紅的地瓜葉高三到十倍。因此對於香椿具有除熱、解毒、止血、殺蟲、治腸炎等藥效，以及近期發現本植物具有抗癌與降血糖之活性，顯示香椿表現出多元化的保健功效，是藥食兼用的食材，值得進一步對此類食材，繼續進行香椿各部位的保健功效評估及其有效活性成分分離與鑑定，並據以建立指標性成分評估方法。
而高醫團隊初步篩選發現香椿對多種癌細胞株生長皆有抑制作用，甚至啟動癌細胞自殺的機制，更重要的是對癌細胞株有很強毒殺作用的濃度下，對於正常細胞並無傷害，開發成保健食品極具潛力，對其有效劃分或成分之研究分析實為刻不容緩，需要團隊的密切合作，才能達到事半功倍之效果。因香椿葉部製備的粗萃物（TSL-1）含有大量抗氧化的植物多酚成份，在團隊抗癌篩選下初步顯示其為主要抗癌活性來源，因此配合高效儀器等作進一步分離，儘可能分離與鑑定出其他有效活性成分，純化出來的各種天然化合物，以各種光譜儀分析，配合判讀各項光譜，並完成建立有效部分（Fractions）之 HPLC 指紋圖，與未來可供驗證的有效指標成分分析方法，或找尋更好的抗癌活性化合物的替代來源。
材料與方法：植物成分與活性之研究
本計畫以香樁幼嫩葉以水煮後得到粗萃物經冷凍乾燥後成粉（TSL），再經以不同比例酒精處理所得溶解性不同之各劃分（fractions）進行分離，此程序獲得的劃分我們將利用種種柱層與儀器，配合研究團隊抗癌生物活性篩選，分離出具有活性之劃分或化合物，純化後並以各種光譜技術與配合各種衍生物之製備，決定化合物之結構，或提供其他計畫進行本食材經再加工程序與貯存後，對保健功效成分之影響與變化的依據。（香椿葉萃取法）：將香椿幼嫩葉加水煮沸 30 分鐘後，以濾網過濾後取出香椿葉，將萃取液以3000rpm、12min、4℃離心處理後，上清液及沉澱物分別以冷凍乾燥法得到粉狀 ( 固體狀 ) 物，分別稱為TSL-1及TSL-1P等。
分離流程先以TSL-1等劃分，分別採開放式大型矽膠（silica
gel, Si gel 60, Merck, 230-400 mesh）柱層層析分離，進一步細分可分別利用正相或逆相矽膠柱層層析（normal or reverse phase silica gel）、矽酸柱層層析（silicic
acid）、氧化鋁柱層層析（aluminum oxide）、分子篩柱層層析（sephadex LH-20）、活性碳等層析材料作為固定相，並配合HPLC（高效液相層析儀）等作細部分離，盡可能分離出各種成分。
構造研究：純化出來的各種天然化合物，以各種光譜儀分析，配合判讀各項光譜MASS、UV、IR、1H-NMR、13C-NMR、 COSY、HETCOR、NOESY、HMBC 等，各純化合物之測定，融點（Melting point），以融點器測定。旋光度（Optical rotation），以數位旋光儀測定。
肺癌細胞毒殺效應：將分離獲得的劃分或是純化合物送與高醫相關團隊進行肺癌細胞毒殺活性篩選。
結果
1. 第一年由高醫大許勝光教授提供之TSL-1粗萃物（99克），進行活性劃分之分離工作，按極性大小共分成18個細劃分，並逐步進入細分的階段，部分細劃分分離獲得一些活性物質，經鑑定出本劃分（TSL-1）主要含有活性物質Gallic acid、Methyl gallate、Ethyl gallate、Kaempferol、Kaempferol-3-O-β-D-glucoside、Quercetin、Quercetin-3-O- β-D-glucoside、Quercitrin、Rutin及Catechin等，並配合團隊肺癌細胞NSCLC（Human non-small-cell lung cancer cells（H520、H661、H441））毒殺活性進行篩選，並建立起香椿TSL-1劃分的指標性成分HPLC圖譜。抗癌活性篩選結果也顯示香椿葉部甲醇粗萃物與TSL-1同具有明顯毒殺NSCLC的作用（P＜0.01）。其中TSL-1的Gallic acid含量，經採HPLC定量與已知濃度比較後，平均含量約10%～13%。
2. 細胞毒殺活性篩選，顯示以不同萃取流程得到的香椿劃分，加入24小時後對NSCLC的毒殺效應結果。而我們也進行香椿各部位的粗萃物對NSCLC的毒殺效應的比較，結果顯示葉部甲醇粗萃物與TSL-1同具有明顯毒殺NSCLC的作用（P＜0.01）。
3. 為進一步了解香椿本畫分（TSL-1）抗癌活性來源，將香椿TSL-1逐次經乙酸乙酯、正丁醇萃取後和最後水層的濃縮物，進行比較各部份NSCLC細胞毒殺效果，結果則顯示毒殺效果大部存在於乙酸乙酯和正丁醇層中，此部份含有已分離的酚類化合物為主，而水層則幾乎沒有毒殺效果。
4. 已提供此部份分離獲得的活性物質，與團隊進行相關後續研究測試，如抗癌、止痛、安全評估等。也進行嘗試製備相關抗癌活性測試較佳的結構修飾，進一歩了解結構與活性的關係。目前已測試Gallic acid (B)、Quercetin、(F)、Methyl
gallate (1)、Syringic acid (3)、Ethyl
gallate (4)、3,5-Dihydroxybenzoic acid (5)、3,4-Dihydroxybenzoic acid (6)、2,4-Dihydroxybenzoic
acid (7)、Pyrogallol (9)、Salicylic
acid (13)等與Gallic acid相似結構的化合物對NSCLC的毒殺效應，目前由結構-活性相關探討結果暫推估，結構中的-COOH基團似乎與癌化細胞辨認位置有某種程度相關，可區分正常與癌化細胞，而結構中的-OH基團則扮演毒殺效應，但相關結果還需更多資料來證明。
5. 部分分離獲得的化合物及有活性劃分，已提供相關團隊進行後續實驗，包含高醫大、成大、中國醫大、東華、義守等，本計劃結案後未來一～二年預計將有2～3篇相關結果陸續發表刊登。
6. 申請國內專利已獲通過，專利證書號數：I235664（源自於香椿葉之萃取物及其製備方法與用途），其餘部分成果也陸續進行專利申請中。
討論
1. 由香樁幼嫩葉以水煮後得到粗萃物經冷凍乾燥後成粉（TSL），再經以不同比例酒精處理所得溶解性不同之各劃分(TSL-1、TSL-2、TSL-2P、TSL-3P、TSL-4、TSL-4P)進行細胞毒殺活性篩選，結果顯示以不同香椿劃分加入24小時後對NSCLC的毒殺效應，以TSL-1及TSL-2的效果最佳，因此推測香椿抗癌活性物其極性應酒精可溶。進一步分析香椿各部位的甲醇粗萃物（葉、莖、皮、材、根）與TSL-1比較，結果顯示香椿葉部甲醇粗萃物與TSL-1同具有明顯毒殺NSCLC的作用（P＜0.01），且毒殺作用以葉部甲醇粗萃物較TSL-1為強，對BEAS-2B的毒殺能力也比較大，這可能是兩者萃取用的溶劑與製備方式的不同所造成。經水煮製備酒精抽提的TSL-1，降低對正常BEAS-2B的細胞毒殺效果，卻仍保有明顯毒殺NSCLC的作用。
2. 本計劃研究香椿TSL-1粗萃物的活性物質分析，以矽膠層析管柱做進一步細部分離，並配合生物活性試驗（Bioassay），作為研究導向指標，再以各種層析方式（Chromatography），進一步分離活性成分。目前分離出Gallic acid、Methyl gallate、Ethyl gallate、Kaempferol、Kaempferol-3-O-β-D-glucoside、Quercetin、Quercetin-3-O- β-D-glucoside、Quercitrin、Rutin及Catechin等化合物，所有分離得到的化合物結構由比對文獻光譜資料（IR、NMR與Mass）解析鑑定出來，本結果雖無新化合物的發現，但由其中分離獲得主量化合物Gallic acid約佔TSL-1總重10～13%，並提供與合作團隊進行生物活性分析，確定為香椿生理活性指標成分之一，因此這些香椿含量豐富的植物酚類化合物，似乎為抗癌活性的重要來源。
3. 已分離獲得化合物Gallic acid、Methyl gallate、Ethyl gallate、Rutin、Quercitrin和Quercetin，已先進行標準品的HPLC指紋圖譜，可做為指標追蹤使用。再進一步分析香椿葉部與TSL-1的HPLC指紋圖譜，結果可看出香椿葉部Methyl gallate及黃酮類Quercetin、Rutin含量較多。TSL-1則以Gallic acid為主，黃酮類次之。因此香椿葉部水煮製備經酒精抽提獲得的TSL-1，降低對正常BEAS-2B的細胞毒殺效果，卻仍保有明顯毒殺NSCLC的作用，似乎與製備過程中Methyl gallate或其他植物酚類化合物轉換成Gallic acid，加強了癌細胞毒殺作用，及黃酮類被保留下來強化保護正常細胞有關，值得做進一步了解與釐清。
4. 針對NSCLC的毒殺效應濃度，第一次粗測採用到0.5 mg/mL，實際上濃度還會降低，因為根據其他團隊不同癌細胞（卵巢癌、子宮頸癌、口腔癌、肝癌與乳癌等）採用的毒殺濃度結果，遠低於此測試濃度甚多。TSL-1的Gallic acid之含量，若採HPLC定量與已知濃度比較後計算，平均含量約10%～13%。
結論與建議
1. 本計畫配合團隊的抗癌活性篩選，完成香椿TSL-1的主量活性成分的分離與鑑定，本畫分活性物質Gallic acid、Methyl gallate、Ethyl gallate、Kaempferol、Kaempferol-3-O- β-D-glucoside、Quercetin、Quercetin-3-O-β-D-glucoside、Quercitrin、Rutin及Catechin。也建立起香椿各部及TSL-1等活性劃分的指標性成分HPLC圖譜。另進行比較非酚類化合物部分之NSCLC細胞毒殺效果，結果顯示毒殺效果大部存在於乙酸乙酯和正丁醇層中。
2. 香椿葉及TSL-1含有多量含多酚的抗氧化成分，非其他來源可如此輕易供給，除已提供此部份分離獲得的活性物質，與團隊進行相關後續研究測試，包含癌細胞毒殺、抗氧化實驗、安全性評估等數批，應可達成相當的研發成果。
3. 計畫雖只進行兩年，但本團隊對香椿的研發已完成跨部會保健食品的目的，除積極將研發成果技術移轉給相關民間公司，也將在學術期刊陸續發表結果，國內專利的通過也驗證創新的成果，可惜的是未能繼續大動物體或人體內活性及安全性測試，確認香椿對人體保健功效，達成推動保健食品的開發。
參考文獻
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香椿抗癌研究之回顧與展望
黃明賢 醫師 高雄醫學大學 胸腔內科
許勝光 教授 高雄醫學大學 生理學科
承蒙由國科會、衛生署和農委會共同成立之「保健食品研究開發計畫」中之國科會給予三年期之研究補助（88年至91年）『降血糖及抗癌的保健食品-香椿之研發及應用』專題研究，香椿之研究於焉展開。
香椿葉對肺癌細胞有抑制生長之效果，經張慧秋博士發現後，我們一夥人就依照申請到之專題研究計劃，將椿葉水萃取液粉劑與人類癌細胞株（肺癌A549、H441、H520、H661、直腸癌Colon 25、骨癌U2-OS、肝癌C3A）一起培養，分析香椿水萃取液對不同癌細胞之增殖及死亡情形，先以體外培養癌細胞株進行實驗。初步以計數細胞數、接下來用MTT〔3- （4 , 5-dimethylthiazol-2-yl）-2, 5-diphenyl
tetrazolium bromide〕assay方法來測定椿葉水萃取液對不同細胞株抑制細胞增殖的情形，再以乳酸脫氫酶（LDH）assay偵測細胞死亡的程度，結果發現香椿水萃取液對上述細胞株生長不同濃度的香椿水萃取液對不同癌細胞株會有不同程度抑制作用。
當年曾報告說：「更特殊的是香椿水萃取液可有效抑制non-small cell lung cancer
cell的生長，但對於H209（small cell lung
cancer cell）之作用反而是促進生長，這是一個很特殊而值得深入來探討之現象。」那時我有提及香椿對於H209（small cell lung cancer cell）之作用實驗只做兩次『MTT』assay測試，一次是作用不明顯，一次是促進生長，故尚不敢下定論。往後由於許多學者認為『茲事體大』，於是我們就另外再重複此實驗，我們將H209（小細胞肺癌）以『MTT』assay方法及以細胞計數『cell count』方法兩種方式來進行，而且是由不同兩個人分別操作，得到的結果為0.5mg/ml及1 mg/ml之香椿濃度均有明顯之抑制H209細胞之生長作用。因我們發現H209肺癌細胞是一種懸浮性細胞，故這次在實驗操作時非常小心，為要讓這次確認實驗有很好之可信度，故分別由不同之兩人負責，故可以確定香椿對H209（小細胞肺癌）細胞是有明顯之抑制生長作用。
當時香椿抗癌之研究已有相當不錯之結果，後來又將香椿之水萃取液粉劑進一步以不同濃度之酒精及多次水再萃取所得之部份，經由冷凍乾燥成粉劑後得到各區分（fraction）原料，加上賈宜琛博士之「香椿水煮粗萃物抗癌有效成分之分離研究」所提供之材料，一並加入探討實驗，如此一來，不僅在各種區分之對各種癌細胞抑制能力強弱已被詳加探討外，有些實驗已將抗癌機制，甚至於裸鼠實驗均有明確結果（包括有卵巢癌細胞、人類骨髓血癌細胞、人類肺癌細胞、前列腺癌細胞、骨癌細胞、黑色素惡性瘤、口腔癌及口腔鱗狀癌細胞。）。為瞭解除了有療效外，是否會傷身體，我們更進一步分析香椿葉萃取物的毒性，結果顯示：對癌細胞株有很強毒殺作用的濃度下，對於正常細胞並無傷害性；而且並沒有觀察到任何明顯的副作用。
香椿在 Human Lung Adenocarcinoma cell 的抗癌效果黃明賢及黃俞榮等人成功大學生物及解剖所香椿在正常 mouse leydig cell steroidogenic 酵素的活性包括p450scc，3β-HSD 17α-hydroxylase
120x-hydroxylase and 17β-HSD 來抑制 testosterone 產生。
香椿之保肝、抗病毒、抗癌之藥理活性及細胞內 NO/cGMP 路徑之調節作用
高雄醫學大學醫學研究所碩士班
研 究
生 林信伶
指導教授 邱慧芬
香椿具明顯保肝作用，
為一具有潛力之保肝、抗病毒及抗肝癌新藥
香椿為中國落葉喬木，本研究將針對香椿進行藥理活性之篩選，包括保肝、抗病毒及抗癌活性之篩選，並對腫瘤細胞生長抑制相關之程式死亡路徑，亦深入地探討對分子相關作用機轉。在保肝活性之測定以四氯化碳(CCl4)在大白鼠誘發之急性肝炎投與不同劑量之香椿(0.001-10.0 mg/kg)後，發現香椿能隨劑量明顯地降低血清中SGOT及SGPT之值。同時以光學顯鏡觀察肝臟切片組織變化，發現香椿隨劑量之增加可明顯改象，並與本研究室歷年來所做過數十種中草藥活性成分相比較，發現其具明顯保肝作用。另外，不同的香椿濃度對人類肝癌細胞(Hep G2)，以MTT及Methylene blue方法測定其對細胞生長之調節或毒殺作用，發現香椿對HepG2之生長有抑制作用，但以濃度1.0 mg/ml為分界，於更高濃度10.0 mg/ml時似有明顯回升現象。其50%抑制生長濃度(IC50)分別為0.517±0.01
mg/ml (MTT)及0.53±0.04 mg/ml
(Methylene blue)。
另外，在c-GMP測定結果則發現香椿(0.01-1.0
mg/ml)會隨濃度造成明顯細胞內c GMP濃度下降之現象，因此NO增加之機轉可能不經由活化c-GMP而是藉由產生過氧自由基離子而發揮細胞毒殺之作用。除此之外，我們亦偵測造成細胞凋亡之下游物質caspase-3之活性，發現香椿具有造成caspase-3活性增加之作用。本研究之結果顯示香椿為一具有潛力之保肝、抗病毒及抗肝癌新藥並對細胞內NO/ cGMP濃度之調節及caspase-3之活化為抗癌活化之重要作用機轉。
香椿葉水萃取液對醋酸引發的臟器痛與化學治療引發的
高雄醫學大學
林志隆、楊雁臣、林曉慧、鄭貴元
楊玉嬌、許勝光、黃明賢
香椿被證實可減輕化學藥物引發的週邊性神經病變，
再加上香椿本身的抗氧化、抗癌作用如（卵巢癌），
其功效是多方面的，
是其他麻醉性止痛藥物所無法比較的，
而且香椿本身無一般止痛藥物之副作用。
研究香椿幼嫩葉之水粗萃取物及其分離物對臟器痛的痛苦性，也研究香椿對化學治療引發的疼痛性週邊神經病變的止痛效果，以期找到香椿幼嫩葉之分離物中何者對臟器痛最具止痛效果，及其最適當之劑量，並評估香椿與其他止痛劑合併使用時的止痛效果，以及香椿萃葉萃取出之純物質測對臟器痛的止痛效果。
研究結果顯示香椿萃取物中止痛的有效分離物為TSL-1，TSL-1減低劑量至0.075g/kg ，仍有47%的止痛效果，再加上香椿本身的抗氧化、抗癌作用如（卵巢癌），其功效是多方面的，是其他麻醉性止痛藥物所無法比較的，而且香椿本身無一般止痛藥物之副作用。TSL-1與morphine合併有加成作業，可減少麻醉性止痛藥物的使用量或減少次數，來減低其伴隨的副作用或成癮性。
香椿在本實驗第一次被證實可減輕化學藥物引發的週邊性神經病變，可更加確定其臟器痛的止痛效果，將肯定其安全性及評估毒性之後，以開發健康食品為目標，再以香椿茶包進行人體試驗。
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